Заказать звонок
Авторы: Кирстен Зауэрман*, Сёрен Ясперс, Урте Куп и Хорст Венк
Краткое содержание
Обоснование
Влияние старения на плотность функциональных структур сосочков кожи, содержащих питательные капилляры, было исследовано в условиях in vivo при помощи системы конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) как в плане изучения изменений папиллярного индекса, так и эффекта местного применения витамина С.
Методы
Зависимость папиллярного индекса от возраста определялась при помощи CLSMв 3 разных возрастных группах. Кроме того, мы определяли эффект крема, содержащего 3% витамин С, по сравнению с кремом без витамина С, путем ежедневных аппликаций в течение четырех месяцев на ладонной поверхности предплечья у 33 женщин.
Результаты
Было выявлено значительное снижение папиллярного индекса, показывающее четкую зависимость от возраста. Аппликация витамина С приводит к значительному увеличению плотности дермальных сосочков после 4 недель применения по сравнению с кремом без витамина С. Воспроизводимость результатов была определена в повторных исследованиях.
Выводы
Витамин С обладает способностью для повышения плотности дермальных сосочков, вероятно, через механизм ангиогенеза. Аппликация витамина С может иметь терапевтический эффект для восстановления регрессивных структурных изменений, связанных с процессом старения.
Обоснование
Последовательной особенностью старения кожи с течением возраста, а также возрастного старения кожи под воздействием солнечной инсоляции является уплощение слоя эпидермиса-кожи на границе эпидермально-дермального соединения, о чем свидетельствует в гистологических срезах потеря сети гребней и исчезновения папиллярных сосочков. Глубина взаимопроникновения сети акантотических тяжей и дермальных сосочков уменьшается с возрастом [1]. При использовании сканирующей конфокальной микроскопии на оптических срезах, в отличие от обычных поперечных срезов, перпендикулярных интересующей поверхности, могут быть получены горизонтальные поверхности. Сравнение конфокальных изображений с соответствующими гистологическими срезами были сделаны группой Gonzales для проверки и валидации метода CLSM [2-5]. В конфокальных изображениях кожные сосочки выглядят как темные круги, окруженные яркими отражающими кольцами базальных клеток, содержащих пигмент с высокой отражательной способностью [6]. Каждый сосочек содержит одну питающую его капиллярную петлю [7]. Плотность этих функциональных объектов из кожного сосочка, содержащего одну питающую капиллярную петлю, можно оценить более точно с помощью конфокальной микроскопии, чем с помощью обычного гистологического исследования. Отчасти это связано с исключением уменьшения размеров артефактов после фиксации, необходимой для выполнения гистологических срезов. Конфокальная микроскопия больше подходит для построения трехмерного изображение, чем обычные серийные гистологические срезы [8].
В глубокой старости кожные сосочки практически исчезают и эпидермально-дермальный переход в случае атрофических изменений эпидермиса представляет собой прямую линию по сравнению с неровной зигзагообразной линией в молодом возрасте. Сосочковый слой дермы также истончается наряду с потерей части капилляров. Groveописывает, что корнеоциты в стареющей коже становятся больше и крупнее в результате уменьшения интенсивности обновления слоев клеток эпидермиса [9]. Аналогично, клетки зернистого слоя становятся больше и крупнее, что указывает на замедленную интенсивность обновления слоев клеток эпидермиса в стареющей коже [6].
Например, в отличие от мышей, в организме человека, как и вообще у приматов и у морских свинок, витамин С должен поступать экзогенно вместе с рационом. Рационы с дефицитом витамина С вызывают многочисленные клинические признаки цинги.
В эволюционном трактате Stones показано, что генетические мутации привели к потере способности человека и некоторых других видов животных синтезировать витамин С [10]. Основным механизмом развития цинги, по-видимому, является нестабильность негидроксилированных форм коллагена, так как витамин С необходим для гидроксилирования пролина [11]. Существует доказательство того, что местное применение витамина С путем нанесения на кожу может быть полезным в различных не связанных между собой обстоятельствах. Местное применение витамина С, как сообщалось, улучшает заживление ран [12]. Roshchupkin показал, что местное витамина С защищает от непосредственного воздействия ультрафиолетового излучения на кожу человека, что приводит к увеличению дозы, необходимой для развития эритемы [13]. Местное применение витамина С путем нанесения на кожу защищает от ультрафиолетового индуцированного канцерогенеза [14]. Уровень витамина С в коже уменьшается с возрастом, особенно в эпидермисе [15,16]. Местное применение витамина С путем нанесения на кожу повышает уровни мРНК коллагенов Iи III, а также метаболизирующих их ферментов у человека [17,18]. Humbert показал способность аскорбиновой кислоты замедлять старение кожи под воздействием инсоляции и уменьшать количество морщин на лице [19, 20].
Как известно, ретиноиды также способны замедлять старение кожи под воздействием инсоляции и способствуют прорастанию сети акантотических тяжей в дерму, восстановлению волнистости интерфейса эпидермально-дермального соединения на гистологическом срезе, перпендикулярном к поверхности кожи [21]. Функциональное эпидермо-дермальное соединение обеспечивает более надежную защиту от механических напряжений, которые могут отделить эпидермис от дермы и привести к эрозии [22]. Повышение поступления кислорода и питательных веществ в кожу должно также повысить репарационные процессы после травматических повреждений и обратного развития структурных изменений, связанных со старением кожи под действием инсоляции.
Измерение толщины эпидермального-дермального соединения принято в качестве параметра обычного гистологического исследования и может быть определено с помощью конфокальной микроскопии только очень приблизительно и неточно из-за горизонтальной ориентации изображения. Во-первых, целью данного исследования является установление измеряемого параметра CLSM, сравнимого с измерением высоты интерфейса эпидермального-дермального соединения на гистологическом срезе. Параметр должен быть чувствительным, чтобы найти связанные с возрастом изменения эпидермально-дермальных интердигитаций. Во-вторых, необходимо изучить влияние местного применения витамина С, содержащегося в увлажняющем креме, на формирование параметров CLSM. Мы использовали витамин С в дозе 3%, так как эта концентрация показывает хорошую устойчивость и хорошее высвобождение активного ингредиента в специальной эмульсионной системе, составляющей базовую основу мази [23].
Методы
В первом эксперименте (I) в трех группах добровольцев разного возраста сравнивались измерения плотности функциональных объектов, состоящих из кожного сосочка и питательного капилляра (папиллярный индекс). Во втором эксперименте (II) местно наносили крем, содержащий 3% витамина С и базовый наполнитель на ладонную поверхность предплечья у 33 добровольцев. Эффект витамина С в креме сравнивали с эффектом базового наполнителя крема, а также с необработанными контрольными участками, соответственно. (III) Этот же эксперимент был повторен с несколько другим носителем для доставки витамина С на протяжении 2 месяцев.
Инструмент
Виваскоп 1000 (ООО «Lucid Inc.», Рочестер, штат Нью-Йорк) является коммерчески доступным конфокальным лазерным сканирующим микроскопом, который позволяет рассматривать человеческую кожу в естественных условиях неинвазивным методом. Система использует в качестве источника лазер с длиной волны 830 нм, осветительной мощностью до 20 мВт на объект и водную иммерсию. Во всех трех исследованиях были использованы два различных поля зрения для измерения папиллярного индекса (640 мкм × 480 мкм) и проекции области клеток в зернистом слое (230 мкм × 88 мкм). Боковое разрешение прибора составляет 0,4 мкм, вертикальное разрешение около 1,9 мкм.
Параметры
В конфокальных изображениях предплечья интерфейс эпидермально-дермального соединения показывает темные круглые зоны кожных сосочков, окруженных яркими кругами базальных клеток, содержащих гранулы меланина и поэтому сильно отражающих свет. Капиллярные петли расположены в центре дермальных сосочков, как черные дыры, при этом часто можно увидеть яркие эритроциты, проходящие через капилляр. Плотность кожных сосочков оценивали путем подсчета сосочков, содержащий капиллярную петлю. При каждом тестировании было исследовано 20 полей зрения.
Размер клеток в верхнем гранулярном слое эпидермиса (Agran) оценивали путем сохранения изображения наиболее апикальной плоскости эпидермиса, в которых все еще определялись живые темные клетки с наличием ядер. В одном изображении вы можете выполнить виртуальные срезы разных слоев клеток, при этом клетки, расположенные прямо под роговым слоем, могут быть идентифицированы по характерным морфологическим особенностям изображения клеток. Размер клеток исследовали с помощью прикладной программы для анализа изображения. Минимум 20 клеток, по крайней мере в трех различных изображениях, были проанализированы с помощью обученных экспертов.
Участники исследования и проводимое лечение
(I) В первом исследовании было изучено три группы женщин-добровольцев: двенадцать – в возрасте от 18 до 25 лет, одиннадцать – в возрасте от 40 до 50 лет и двенадцать – в возрасте 65 до 80 лет. У них было получено информированное согласие. У участниц были выполнены изображения кожи на ладонной стороне правого предплечья в течение зимних месяцев.
(II) Во втором эксперименте действие крема, содержащего 3% витамина С сравнивалось с мазевой основой крема без витамина С в группе лиц, первоначально насчитывающих 36 добровольцев. К концу исследования 33 добровольца стали использовать крем два раза в день. Аппликации крема в течение 4-х месяцев наносились на кожу в области середины ладонной поверхности предплечья у здоровых испытуемых женщин в возрасте от 45 до 67 лет (в среднем 55,3 лет), II и III фототипа и находящихся в периоде постменопаузы. На одну из областей (поверхность кожи левого предплечья), лекарственный препарат не наносился. В зимний период было проведено двойное слепое исследование. У участников было получено информированное согласие. Анализировались оценки, полученные до начала исследования и каждый месяц в течение четырех месяцев, с одним и двумя месяцами наблюдения после прекращения лечения.
(III) Для определения воспроизводимости результатов было выполнено второе исследование в течение 8 недель – всего периода лечения с несколько иным способом доставки витамина С. Основное внимание исследователей было сосредоточено на папиллярном индексе. У участников было получено информированное согласие. Измерения проводились после 20 минут акклиматизации при 21 °C и относительной влажности воздуха 50%.
Статистика
Морфометрические результаты выражены в ящиковых диаграммах с «усами» – пограничными параметрами медианы +/- квартиль. В статистическом анализе использовали критерий Стьюдента для нормально распределенных данных или U-Test (Манна-Уитни) для изучения сравнения возрастных категорий. Тест Вилкоксона использовался для анализа влияния витамина С. Статистически значимым считался 95% уровень достоверности (р <0,05).
Результаты
(I) Папиллярный индекс в группе испытуемых молодого возраста со средним значением 54,3 сосочков на мм2 был самым высоким из трех возрастных групп. В группе испытуемых среднего возраста определялся значительно более высокий показатель папиллярного индекса со средним значением 29,6 сосочков на мм2, чем в самой старшей группе, где медиана папиллярного индекса составила 24,7 сосочков на мм2. Снижение папиллярного индекса было более выраженным между испытуемыми в младшей возрастной группе (от 18 до 25 лет) и в группе среднего возраста (от 40 до 50 лет), чем между этой группой и группой испытуемых пожилого возраста (от 65 до 80 лет) (рис. 1)
Рисунок 1. Статистические «ящиковые» диаграммы, отражающие количество сосочков на мм2 в трех возрастных группах
В группе участников пожилого возраста часто определялись большие сегменты плоских участков эпидермально-дермального переходов с полной потерей сосочков. В этих регионах микрососуды были представлены горизонтально ориентированными сосудами, имеющими заметно большие диаметры, чем в коже молодых людей, вероятно, венул, а не капилляров. Небольшое количество скрученных остатков капиллярных петель изредка встречались под атрофически измененным эпидермисом.
В стенках сосудов с помощью конфокального исследования нельзя дифференцировать эндотелий, перициты или гладкомышечные клетки, в связи с низкой рефлективностью данных структур.
(II) После четырех недель лечебных аппликаций аскорбиновой кислоты на обработанных участках кожи определялась значительно более высокая плотность сосочков, содержащих капилляры, чем на необработанных участках, а также участках кожи, обработанных мазевой основой крема (Рисунок 2, р-значения в таблице 1).
Рисунок 2. Статистические «ящиковые» диаграммы, отражающие количество сосочков на мм2 в течение периода местного применения витамина С; t0 = базовый уровень до начала лечения, с t1 по t4 = 1 – 4 месяцы лечения, t5 и t6 = 1 и 2 месяца после отмены препарата
Таблица 1. Статистический анализ исследования лечения: р-уровни, парный теста Вилкоксона.
|
|
мазевая основа по сравнению с исследуемым препаратом |
отсутствие лечения по сравнению с исследуемым препаратом |
отсутствие лечения по сравнению с мазевая основа |
|
|
|||
|
t0 |
58,70% |
21,10% |
36,40% |
|
t1 |
1,40% |
0,35% |
95,00% |
|
t2 |
0,03% |
0,02% |
62,60% |
|
t3 |
0,02% |
0,03% |
97,00% |
|
t4 |
0,01% |
0,01% |
87,30% |
|
t5 |
0,60% |
15,30% |
28,10% |
|
t6 |
4,28% |
12,50% |
77,30% |
Статистически значимые различия наблюдались также в участках кожи, обработанных витамином С в течение 4 недель по сравнению с состоянием перед началом исследования. На необработанных и обработанных мазевой основой крема участках кожи определялось небольшое, но значимое увеличение (значения медианы от 25,3 до 26,9 сосочков на мм2 для необработанной и значения медианы от 22,7 до 30,3 сосочков на мм2 для мазевой основы крема) также в течение всего периода лечения.
Значимые различия сосочкового индекса, определяемого на участках кожи, обработанных витамином С и двух контрольных участках исчезали через два месяца после прекращения лечения. Несмотря на различные значения медианы папиллярного индекса для участков кожи, обработанных витамином С, и двух контрольных участков при определении базового уровня до начала лечения (t0), никаких статистически значимых различий между этими исходными значениями не обнаружено.
Стоит отметить, что вновь сформированные сосочки не отличались от ранее существовавших. Не наблюдались ни такие аномальные образования кровеносных сосудов, как наличие нескольких капилляров в одном сосочке, параллелизм сосудов или сосуды, значительно увеличенные в диаметре, ни признаков воспалительных реакций, например, наличие в просвете сосудов большого количества лейкоцитов или адгезию лейкоцитов к стенкам сосудов.
Проекционные области в верхнем слое гранулированных клеток эпидермиса статистически значимо уменьшились до 16% от 472 мкм2 до 383 мкм2 на обработанных витамином С участках кожи по сравнению с базовыми показателями до начала лечения и значениями данного показателя на двух контрольных участках. Статистически значимой разницы между данными показателями для обработанных мазевой основой крема участков кожи и необработанных контрольных участков при сравнении друг с другом и с начальным статусом до начала исследования не было обнаружено (Рис. 3).
Рисунок 3. Статистические «ящиковые» диаграммы, отражающие площадь (мкм2) клеток в апикальной части зернистого слоя; t0 = базовый уровень, t2 = после 2-х месяцев лечения
(III) Увеличение плотности расположения сосочков под влиянием витамина С было воспроизведено при повторном лечении по той же схеме, что исключает вероятность случайных изменений.
Обсуждение
Уменьшение толщины эпидермального-дермального перехода, наблюдаемое при гистологическом исследовании, является фактом, подробно описанным в литературе, и наблюдается при естественном старении кожи, а также при старении кожи, связанном с инсоляцией [22,24]. Анализируя наши данные, мы пришли к выводу, что старение приводит к повреждению папиллярных сосочков дермы и сосудистой сети в этом слое кожи и уменьшению плотности расположения сосочков на единицу площади с течением времени.
Витамин С, как сообщалось, уменьшает клинические признаки фотостарения кожи и усиливает синтез композитных волокон эластина и коллагена [19]. Наши данные свидетельствуют о том, что местное применение витамина С частично восстанавливает анатомическую структуру эпидермального-дермального перехода в коже молодых людей и увеличивает количество питательных капиллярных петель в сосочках дермы, располагающихся близко к эпидермису в коже женщин, находящихся в периоде постменопаузы. Увеличение плотности сосочков после лечения витамином С не может быть истолковано только как признак эпидермальной гиперплазии с увеличенной площади, покрытой базальным слоем эпидермиса и растущего вниз в дерму. Скорее всего, это связано с реструктуризацией сосочкового слоя дермы, а в верхней части новообразованных сосочков капилляры были локализованы выше средней высоты уровня базального слоя преимущественно в стареющей коже. Это говорит о репарации и возвращению к более нормальному функциональному состоянию эпидермально-дермального соединения и вышележащего эпидермиса.
В стареющей коже клетки в апикальном зернистом слое занимают большие проекционные площади, чем в коже молодых людей [8], что согласуется с феноменом увеличения размеров корнеоцитов с возрастом, описанным ранее Groveи Kligman[9]. Kligman показывает обратную зависимость между интенсивностью обновления слоев клеток эпидермиса и размером корнеоцитов [9]. Аналогичное соотношение было показано для размера клеток в зернистом слое [25]. Параллельно с этим установлено, что уменьшение размера зернистого слоя клеток в участках, обработанных витамином C, может быть интерпретировано как признак повышенной пролиферативной активности эпидермиса.
Еще одним следствием увеличения количества сосочков является образование новых кровеносных сосудов в процессе обработки кожи витамином С. Вновь образованные сосуды имеют нормальное анатомическое строение в конфокальном микроскопическом исследовании и, по-видимому, интегрированы в здоровое сосудистое русло с нормальной архитектоникой. На конфокальных изображениях нет признаков патологических сосудистых изменений, таких как, например, увеличенного диаметра сосудов, параллельной ориентации или формирования уродливых клубков сосудов в сосочках. Не наблюдалось и образования периваскулярных инфильтратов из лимфоцитов в течение всего периода лечения.
Механизм, с помощью которого витамин С восстанавливает кожные сосочки, остается неизвестным.
Выводы
Это первые результаты, которые явно подразумевают, что местное применение витамина С может иметь важные омолаживающие эффекты для коррекции структурных и функциональных нарушений, связанных со старением кожи.
