Воспалительный ответ у пациентов с ожоговой травмой: никотин снижает уровни провоспалительных цитокинов

Авторы: L. Claassen, MD, S. Papst, MD, K. Reimers, PhD, C. Stukenborg-Colsman, MD, L. Steinstraesser, MD, P. M. Vogt, MD, T. Kraft, PhD, A. D. Niederbichler, MD

Источник: ePlasty

Перевод: Delis.pro; при перепечатке статьи гиперссылка на www.delis.pro в начале и в конце статьи обязательна.

 

 

Аннотация

Цель исследования. Иммунный ответ на воспалительный стимул сбалансирован и представлен широким спектром стимулирующих и ингибирующих факторов. После термической травмы этот баланс нарушается, в результате чего развивается чрезмерная иммунная реакция с увеличением продукции и высвобождением провоспалительных цитокинов. В результате появляется никотин-стимулированный противовоспалительный рефлекс. Целью данного исследования было подтверждение того, что трансдермальное введение никотина подавляет высвобождение провоспалительных цитокинов после ожоговой травмы.

Методы. У крыс линии Спрэг-Доули использовали модель ожога 30% общей площади поверхности тела на всю толщину кожи (n = 35, самцы). Экспериментальные животные были разделены на контрольную группу, группу животных, получивших ожоговую травму, а также группу животных, получивших ожоговую травму с дополнительным лечением никотином и группу симуляции + лечение никотином. Размер каждой группы был равен 5 экспериментальным животным. Последние 2 группы получили никотин трансдермально в дозе 1,75 мг. Концентрации фактора некроза опухоли альфа, интерлейкина 1 бета и интерлейкина 6 определяли в гомогенатах сердца, печени, селезенки через 12 или 24 часов после ожоговой травмы.

Результаты. Экспериментальная ожоговая травма привела к значительному увеличению уровней цитокинов в сердце, печени и селезенке. Лечение никотином приводит к уменьшению эффекта ожоговой травмы со значительно более низкими концентрациями фактора некроза опухоли альфа, интерлейкина 1 бета и интерлейкина 6 по сравнению с контрольной группой травмы.

Выводы. При помощи стандартизованной ожоговой модели это исследование подтверждает, что стимуляция никотиновых рецепторов ацетилхолина участвует в регуляции эффекторных молекул иммунной реакции. Принимая во внимание результаты нашего исследования, дальнейшие эксперименты, направленные на изучение и оценку потенциала и механизмов иммуномодулирующих эффектов этой системы рецепторов, являются оправданными.

Введение

Тяжелая ожоговая травма вызывает провоспалительный иммунный ответ. Увеличение продукции и высвобождение провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), интерлейкин-1 бета (IL-1β) и интерлейкин 6 (IL-6), является очевидным патогенетическим фактором [1, 2]. Концентрации этих провоспалительных цитокинов достигают своих максимальных уровней в период между 12 и 24 часами после ожоговой травмы [1].

Существует связь между нервной и иммунной системой [3, 4]. Центральная нервная система оказывает ключевое влияние на иммунные ответы через блуждающий нерв [5, 6]. Трейси назвал комплексный иммунный ответ на парасимпатический стимул "воспалительным рефлексом" [7]. Эфферентная часть этого рефлекса была названа термином "холинергический противовоспалительный путь" из-за того, что первичным нейромедиатором, идентифицированном в работе данного пути, явился ацетилхолин [8]. Блуждающий нерв иннервирует большую часть внутренних органов, в том числе содержащих части ретикулоэндотелиальной системы, такие как печень, селезенка и сердце. Клетками-мишенями противовоспалительного эффекта являются прежде всего макрофаги, обладающие эффективными ингибирующими свойствами [5, 6].

Воспалительный рефлекс можно стимулировать фармакологически ацетилхолином и, кроме того, рецепторными агонистами никотина [9]. Кроме того, описывается «классическая» альвеолярная резорбция никотина (ингаляция табачного дыма) и его трансдермальное поглощение. Методика трансдермального применения никотина была разработана в контексте отказа от курения и экспериментально используется в исследованиях ряда исследовательских групп [10-12]. Противовоспалительные эффекты никотина, как предполагается, проявляются опосредованно через н-холинорецептор (nAChR) в парасимпатической нервной системе [13]. nAChR был обнаружен во многих системах органов и клетках организма. Макрофаги и моноциты экспрессируют nAChR-рецепторы в их клеточной мембране. Активация приводит к снижению эндоцитарной и фагоцитарной активности. Это приводит к снижению присутствия антигенов, что очень важно для инициализации иммунного ответа [13, 14].

Настоящее исследование было проведено для оценки потенциальных эффектов трансдермальной никотиновой терапии на воспалительный ответ после ожоговой травмы.

 

Материал и методы.

Дизайн исследования

Исследование было проведено на самцах крыс линии Спрэг-Доули (из лаборатории CharlesRiver) весом от 300 г до 350 г. Эксперименты проводились в соответствии со стандартами и положениями Закона об охране животных и немецкого общества экспериментальных испытаний на животных (протокол исследования № 05/1052). Университетский комитет по использованию и охране животных и Государственное управление Нижней Саксонии по защите прав потребителей и безопасности пищевых продуктов (LAVES, Ольденбург, Германия) утвердили протокол экспериментов.

Были созданы семь изучаемых групп, каждая из которых включала N = 5 животных. В исследовании была выделена одна контрольная группа (CTRL). Остальные 6 групп были разделены на 3 подгруппы, в которых извлечение органов производилось после 12 часов, и 3 подгруппы, в которых органы извлекали после 24 часов. В этих 2 временных точках добавлялась группа ожоговой травмы (BURN 12 и BURN 24), группа ожоговой травмы с введением никотина при помощи никотинового пластыря (BURN12 + никотин и BURN 24 + никотин) и симулированная контрольная группа с применением никотина (SHAM + никотин через 12 часов и SHAM + никотин через 24 часа) (рис 1).

              Рисунок 1.

Экспериментальные группы. Изображена классификация 35 экспериментальных животных в 7 экспериментальных группах с 5 экспериментальными животными в каждой. Мы сравнили уровни цитокинов через 12 часов и 24 часа после экспериментальной ожоговой травмы с данными контрольной группы.

Процедура получения ожоговой травмы и возмещения жидкости

Под изофлурановым наркозом коротко обрезали волосы на спине. Затем крыс помещали в изготовленное заводским способом устройство с прямоугольным отверстием площадью 2,1 см², через которое воздействовали на дорсальную поверхность кожи спины, защищая оставшуюся кожу от воздействия ожога. Открытую поверхность кожи погружали в воду с температурой 60 °C в течение 40 секунд, чтобы вызвать ожог 30% общей площади поверхности тела всей толщины кожи, как было описано ранее [15]. Симулированных (Sham) животных подвергали идентичной процедуре, за исключением того, что их погружали в воду комнатной температуры (24 °С). Животных контрольной группы не погружали в воду комнатной температуры.

Применение никотина.

Никотин применяли при помощи никотинового пластыря (Никоретте, Fa. PfizerConsumerHealthcare, Карлсруэ, Германия). Размер никотинового пластыря выбирали на основе исследования Kalra и коллег, при этом выбирались такие уровни котинина в сыворотке крови, которые характерны для сильных курильщиков, приблизительно 850 нг/мл [16]. Пластырь высвобождает никотин в дозе 1,75 мг. Животные из групп BURN + никотин и SHAM + никотин получали лечение никотином.

Анализ изоляции ткани и секреции цитокинов (иммуноферментный анализ)

Под анестезией изофлураном выполняли лапаротомию через срединный разрез. Впоследствии выполняли двустороннюю торакотомию, сердце быстро удаляли и промывали в охлажденном льдом, изотоническом и стерильном фосфатно-солевом растворе. Куски ткани левого желудочка, печени, селезенки вырезали, взвешивали и сразу замораживали в жидком азоте для последующей обработки.

Цельной крови давали возможность свернуться в течение 2 часов при комнатной температуре, а затем центрифугировали при 1000 gпри температуре 4 °С в течение 20 минут для отделения сыворотки от корпускулярных элементов, а сывороточный супернатант отсасывали пипеткой и замораживали для дальнейшей оценки.

Сто миллиграмм ткани гомогенизировали в 1000 мкл охлажденного льдом буфера RIPA, состоящего из 0,3 М NaCl, 20 мМ Трис-HClи рН 8,1% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS, 1% Тритон Х-100, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ФМСФ и ингибитора протеазы (CompleteX, Рош, Индианаполис, штат Индиана). Гомогенаты центрифугировали в количестве 3000 г в течение 5 мин при температуре 48 °С, собирали супернатант и хранили при температуре -80 °С до использования.  Уровни TNF-α, IL-1β и IL-6 крыс измеряли с помощью фермент-связанного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерчески доступных антител и стандартов, указанных в инструкции изготовителя (Quantikine, R & DSystems, Wiesbaden, Германия). Котинин, продукт распада никотина, определяли в образцах сыворотки (Fa. Calbiotech, SpringValley, Калифорния). Оптическую плотность оценивали с использованием автоматического планшет-ридера, установленного на длину волны 450 нм с коррекцией чтения 540 нм (Infinite 200, TECANGmbH, Крайльсхайм, Германия). Концентрации цитокинов определяли из стандартной кривой и выражали в пг/мл.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Prism 5 (GraphPadInc, LaJolla, California). Был использован дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным анализом по методу Тьюки. Статистическая значимость была установлена на уровне P ≤ 0,05. Результаты выражались в виде средних значений ± стандартного отклонения (СО). Для повышения четкости наших данных мы остановились на результатах статистического анализа между CTRL и BURN группой и между группами BURN и BURN + никотин. Статистический анализ был проведен в соответствии с методами нашего института биометрии.

 

Результаты.

Концентрация котинина в сыворотке крови

Концентрации котинина CTRL и BURN группы были ниже предела обнаружения ELISA, составлявшего 5 нг/мл. В отличие от этого, значения в группах экспериментальных животных с применением никотина значительно увеличились (рис 2а и 2b, белые и черные столбцы по сравнению с полосатым и серыми столбцами, P <0,001). Через 24 часа значения соответствующих групп были ниже, чем через 12 часа, эти различия не были статистически значимыми.

             Рисунок 2.

 

Сывороточная концентрация котинина. Повышение концентрации котинина в сыворотке крови экспериментальных животных с трансдермальным нанесением никотина (полосатые и серые столбцы). В противоположность этому, концентрация котинина оставалась ниже предела обнаружения в сыворотке экспериментальных животных без нанесения никотина. Значения котинина представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Каждый столбец представлен N = 5 экспериментальными случаями.

Концентрации цитокинов в гомогенатах органов

Анализ уровня TNF-α в гомогенате сердца показал заметный рост уровней TNF-α у животных группы BURN по сравнению с группой CTRL и SHAM + никотин. В группе BURN12 его концентрация составила 8,6 ± 0,1 пг/мл и в группе SHAM 24 она составила 7,9 ± 0,1 пг/мл (рис. 3а и 3б, черные столбцы, ANOVA, P <0,001). Применение никотина вызвало значительное снижение продукции сердечного TNF-α (рис. 3а и 3б, черные столбцы по сравнению с полосатыми, ANOVA, p <0,05). Концентрация TNF-α в группе BURN 12 + никотин составила 6,9 ± 0,1 пг/мл и в группе BURN 24 + никотин она составила 6,6 ± 0,7 пг/мл.

             Рисунок 3.

 

Концентрация цитокинов в сердечных гомогенатах (a) и (b), концентрация TNF-α в сердечных гомогенатах (с) и (d), уровни IL-1β в сердечных гомогенатах, концентрация IL-6 в сердечных гомогенатах (e) и (f). В каждой диаграмме наблюдается значительное увеличение цитокинов вследствие экспериментального ожога по сравнению с контрольной группой (черные столбцы по сравнению с белыми столбцами). Также наблюдалось значительное снижение повышенных уровней цитокинов при трансдермальном применении никотина для TNF-α и IL-1β (черные столбцы против полосатых). Значения параметров представлены в виде среднего значения ± стандартного отклонения. Каждый столбец представлен N = 5 экспериментальными случаями.

В сердечных гомогенатах, исследованных на IL-1β, мы обнаружили его значительное увеличение в тканях, полученных в группе BURN по сравнению с группой SHAM + никотин и CTRL (рис 3С и 3D, черные столбцы по сравнению с серыми и белыми столбцы, ANOVA, P <0,001). Ожоговое повреждение после применения никотина индуцировало значительно более низкую продукцию сердцем IL-1β по сравнению с животными, не получавшими лечение никотином. Однако уровни IL-1β в группе BURN + никотин были по-прежнему значительно выше, чем в контрольной группе животных CTRL(рис. 3С и 3D, полосатые столбцы по сравнению с белыми столбцами, ANOVA, p <0,05).

Концентрации интерлейкина 6 достигли уровня около 2200 пг/мл в сердечных гомогенатах животных с ожоговым повреждением (рис 3e и 3f, черные столбцы). Средний исходный уровень IL-6 у контрольных животных составлял приблизительно 1200 пг/мл (рис. 3e и 3f, белые столбцы). Применение никотина индуцирует небольшое снижение продукции IL-6 по сравнению с группой животных BURN.

Все эксперименты с цитокинами в гомогенатах печени показали значительное увеличение уровня оцениваемого цитокина при сравнении животных, получивших ожоговую травму, с группой животных SHAM + никотин или CTRL. В гомогенатах печени мы обнаружили, что исходная концентрация TNF-α составила около 70 пг/мл в группе контрольных животных и аналогичные значения у животных группы SHAM + никотин (рис 4а и 4б, серые и белые столбцы). В гомогенатах печени в группе животных с ожоговым повреждением средние концентрации TNF-α составили 104,4 ± 2,3 пг/мл через 12 часов и 91,4 ± 2,0 пг/мл через 24 часа (рис 4а и 4б, черные столбцы, ANOVA, p <0,001). В противоположность этому, в группе BURN + никотин концентрации уменьшилось до уровня 86,1 ± 2,3 пг/мл и 83,6 ± 2,4 пг/мл (рис.4а и 4b, полосатые столбцы, через 12 часов ANOVA, p <0,001; через 24 часа существенно не изменились).

             Рисунок 4.

 

Концентрации цитокинов в гомогенатах печени: (a) и (b), концентрация TNF-α в гомогенатах печени (с) и (d), уровни IL-1β в гомогенатах печени, концентрация IL-6 в гомогенатах печени (e) и (f). Экспериментальная ожоговая травма привела к значительному увеличению уровней цитокинов по сравнению с контрольной группой (черные столбцы по сравнению с белыми). Уменьшение индуцированного ожоговой травмой повышения концентрации цитокинов в связи с трансдермальной аппликацией никотина было статистически релевантно, за исключением уровня TNF-αчерез 24 часа (полосатые столбцы по сравнению с черными). Значения представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Каждый столбец представлен N = 5 экспериментальными случаями.

Значительное снижение уровней IL-1β наблюдалось при сравнении результатов ИФА-исследования гомогената печени из группы ожоговых животных с группой животных BURN + никотин (рис 4C и 4D, черные и полосатые столбцы, ANOVA, p < 0,05). Уровни интерлейкина 1 бета в группах BURN и BURN + никотин не достигли исходного уровня контрольной группы CTRL (рис. 4C и 4D, черные и полосатые столбцы по сравнению с белыми).

Рассматривая концентрации IL-6 в гомогенатах печени после ожоговой травмой, мы обнаружили средние значения уровней IL-6 от 3000 до 4000 пг/мл (рис. 4e и 4f, черные столбцы). Когда получившим ожоговую травму животным наносили местно никотин, концентрация IL-6 в гомогенатах печени значительно снизилась по сравнению с группой получивших ожог животных (рис. 4е и 4f, полосатые столбцы по сравнению с черными, ANOVA, p < 0,001).

Самые высокие уровни TNF-α в гомогенатах селезенки были найдены в ожоговой группе со значениями 53,7 ± 2,3 пг/мл для группы BURN 12 и 55,5 ± 1,0 пг/мл для группы BURN 24 (рис. 5а и 5б, черные столбцы). Экспериментальная ожоговая травма привела к значительному увеличению уровней IL-1β и IL-6 в гомогенатах селезенки. Во всех случаях, за исключением уровня IL-6 через 24 часа, трансдермальная аппликация никотина привела к значительному снижению концентрации цитокинов (рис 5а-5f, полосатые столбцы по сравнению с черными).

             Рисунок 5.

 

Концентрации цитокинов в гомогенатах селезенки: (a) и (b), концентрация TNF-α в гомогенатах селезенки (с) и (d), уровни IL-1β в гомогенатах селезенки, концентрация IL-6 в гомогенатах селезенки (e) и (f). Также как в сердечных и печеночных гомогенатах, результаты ожоговой травмы приводили к значительному повышению уровней провоспалительных цитокинов в гомогенатах селезенки (черные столбцы по сравнению белыми). Также наблюдалось значительное уменьшение индуцированного ожоговой травмой повышения концентрации цитокинов вследствие трансдермальной аппликации никотина, за исключением IL-6 через 24 часа (полосатые столбцы по сравнению с черными). Значения представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Каждый столбец представлен N = 5 экспериментальными случаями.

 

Обсуждение

Тяжелое термическое повреждение вызывает несколько патофизиологических изменений, ведущих к смерти и инвалидности у пациентов с тяжелыми ожогами. Многофакторный патогенез ожогово-индуцированной полиорганной дисфункции был широко описан в литературе. Важным глобальным патогенным фактором является дисбаланс иммунной системы [1]. С помощью настоящего исследования мы детализировали информацию о высвобождении TNF-α, IL-1β и IL-6 после ожоговой травмы в 3 соответствующих органах. Кроме того, мы можем показать, что аппликация никотина достаточна для ослабления концентрации этих провоспалительных цитокинов после ожоговой травмы.

Наши собственные предыдущие результаты и результаты других исследователей показали, что электрическая стимуляция парасимпатической системы, например, стимуляция блуждающего нерва, также вызывает ослабление воспалительных маркеров ответа. Прямая электрическая стимуляция блуждающего нерва вызывает противовоспалительный эффект, который, в свою очередь, выражен снижением уровня TNF-α, IL-1β и ИЛ-6 в подгруппах экспериментальных животных с ожоговой травмой и лечением никотином [9, 17, 18]. В настоящем исследовании воспалительный рефлекс фармакологически индуцировался с помощью трансдермального применения никотина посредством коммерчески доступного никотинового пластыря. Фармакологическая стимуляция перорального и трансдермального введения никотина продемонстрировала свою противовоспалительное действие. Клинически это была продемонстрировано у пациентов с хроническим воспалительным заболеванием кишечника [10, 11]. Фармакологическая стимуляция с применением трансдермального никотина имеет дополнительные преимущества. Имеется клинический опыт этого подхода к лечению, который не является инвазивным.

Тем не менее, изолированное применение никотина не может сравниваться с поступлением никотина при курении табачных изделий. Табачный дым содержит более 4800 токсичных и канцерогенных веществ. Девяносто из этих ингредиентов были идентифицированы как канцерогенные вещества [19]. Следует подчеркнуть, что результаты литературных исследований, а также результаты данного исследования основаны только на трансдермальном введении никотина и, следовательно, не стоит забывать о вредном воздействии табачного дыма при табакокурении.

TNF-α, IL-1β и IL-6 были описаны как провоспалительные цитокины. Их пригодность в качестве показателей активности или влияния иммунного ответа после ожоговой травмы было продемонстрировано данными многочисленных предыдущих исследований [18, 20-22]. Несмотря на обширные исследования по кинетике воспалительного ответа после ожоговой травмы, концентрации из этих цитокинов в органах, таких как сердце, печень, селезенка и после ожоговой травмы оставались неизвестными.

 

Было обнаружено, что в гомогенатах сердца, печени и селезенки значительно увеличились уровни TNF-α, IL-1β и ИЛ-6. Эти результаты хорошо коррелируют с данными, опубликованными ранее Gauglitz и коллегами [1]. В данной группе обнаружено увеличение уровней IL-1β и IL-6 в сыворотке крови через 12 часов и через 24 часа после ожога. В гомогенатах изолированных кардиомиоцитов повышенные уровни TNF-α, IL-1β и IL-6 были найдены в различные моменты времени, в том числе спустя 12 и 24 часа после ожога [2]. Кроме того, в отдельных кардиомиоцитах крыс концентрации TNF-α, IL-1β и IL-6 быстро увеличиваются после нанесения травмы или активизации воспалительных реакций, соответственно [18, 22]. В моделях, использующих индукцию эндотоксина в условиях invitro, также сообщалось о повышенных уровнях цитокинов в гомогенатах печени спустя 3 часа после ожоговой травмы [18]. В настоящем исследовании было показано, что трансдермальное применение никотина приводило к снижению повышенных посттравматических уровней цитокинов в гомогенатах сердца и печени (рис. 3а-F и 4а-F).

Наши данные свидетельствуют о положительных эффектах никотина на посттравматическую гипервоспалительную реакцию. Трансдермальное применение никотина привело к значительно повышенным уровням сывороточного котинина и снижению концентрации провоспалительных цитокинов. Тем не менее, точный механизм действия никотина до сих пор остается неизвестным. Представляется весьма интересным выяснить, может ли никотин снизить летальность среди больных с ожоговой травмой. Таким образом, результаты должны побудить исследователей к дальнейшему изучению воспалительного рефлекса и особенностей лечения ожоговых больных.

 

Список литературы

1. Gauglitz GG, Song J, Herndon DN, et al. Characterization of the inflammatory response during acute and post-acute phases after severe burn. Shock. 2008;30(5):503–7.
2. Maass DL, White J, Horton JW. IL-1beta and IL-6 act synergistically with TNF-alpha to alter cardiac contractile function after burn trauma. Shock. 2002;18(4):360–6.
3. Blalock JE. The immune system as the sixth sense. J Intern Med. 2005;257(2):126–38.
4. Andersson J. The inflammatory reflex—introduction. J Intern Med. 2005;257(2):122–5.
5. Czura CJ, Tracey KJ. Autonomic neural regulation of immunity. J Intern Med. 2005;257(2):156–66.
6. Tracey KJ. Physiology and immunology of the cholinergic anti-inflammatory pathway. J Clin Invest. 2007;117(2):289–96.
7. Tracey KJ. The inflammatory reflex. Nature. 2002;420(6917):853–9.
8. Borovikova LV, Ivanova S, Zhang M, et al. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature. 2000;405(6785):458–62.
9. Bernik TR, Friedman SG, Ochani M, et al. Pharmacological stimulation of the cholinergic antiinflammatory pathway. J Exp Med. 2002;195(6):781–8.
10. Sandborn WJ. Nicotine therapy for ulcerative colitis: a review of rationale, mechanisms, pharmacology, and clinical results. Am J Gastroenterol. 1999;94(5):1161–71.
11. Guslandi M. Nicotine treatment for ulcerative colitis. Br J Clin Pharmacol. 1999;48(4):481–4.
12. Richardson CE, Morgan JM, Jasani B, et al. Effect of smoking and transdermal nicotine on colonic nicotinic acetylcholine receptors in ulcerative colitis. QJM. 2003;96(1):57–65.
13. de Jonge WJ, Ulloa L. The alpha7 nicotinic acetylcholine receptor as a pharmacological target for inflammation. Br J Pharmacol. 2007;151(7):915–29.
14. Wang H, Yu M, Ochani M, et al. Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation. Nature. 2003;421(6921):384–8.
15. Steinstraesser L, Fohn M, Klein RD, et al. Feasibility of biolistic gene therapy in burns. Shock. 2001;15(4):272–7.
16. Kalra R, Singh SP, Pena-Philippides JC, Langley RJ, Razani-Boroujerdi S, Sopori ML. Immunosuppressive and anti-inflammatory effects of nicotine administered by patch in an animal model. Clin Diagn Lab Immunol. 2004;11(3):563–8.
17. Altavilla D, Guarini S, Bitto A, et al. Activation of the cholinergic anti-inflammatory pathway reduces NF-kappab activation, blunts TNF-alpha production, and protects against splanchic artery occlusion shock. Shock. 2006;25(5):500–6.
18. Niederbichler AD, Papst S, Claassen L, et al. Burn-induced organ dysfunction: vagus nerve stimulation attenuates organ and serum cytokine levels. Burns. 2009;35(6):783–9.
19. Nair U, Thielmann HW, Pötschke-Langer M. Deutsches Krebsforschungszentrum (Hrsg.): Krebserzeugende Substanzen im Tabakrauch, Heidelberg, 2009.
20. Sambol JT, White J, Horton JW, Deitch EA. Burn-induced impairment of cardiac contractile function is due to gut-derived factors transported in mesenteric lymph. Shock. 2002;18(3):272–6.
21. Horton JW. Left ventricular contractile dysfunction as a complication of thermal injury. Shock. 2004;22(6):495–507.
22. Niederbichler AD, Westfall MV, Su GL, et al. Cardiomyocyte function after burn injury and lipopolysaccharide exposure: single-cell contraction analysis and cytokine secretion profile. Shock. 2006;25(2):176–83.